Atualmente, o uso do modelo animal em pesquisas está sob debate ético apesar de ser amplamente utilizado para a avaliação de toxicidade de compostos. As estratégias de melhoria na condução ética da experimentação animal passam pelo uso da legislação e de diretrizes. O panorama internacional e a Diretriz Brasileira de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para fins Científicos e Didáticos (DBCA) de 2013 fomentam e privilegiam o princípio dos 3Rs: Reduction ou Redução, que reflete a obtenção de nível equiparável de informação com o uso de menos animais; Refinement ou Refinamento, que promove o alívio ou a minimização da dor, sofrimento ou estresse do animal e Replacement ou Substituição, que estabelece que um determinado objetivo seja alcançado sem o uso de animais vertebrados vivos.
Dentro desse princípio, pesquisadores e técnicos do Laboratório de Ecotoxicologia e Biossegurança (LEB) da Embrapa Meio Ambiente (Jaguariúna, SP) realizaram ensaios com embriões do peixe “zebrafish” (Danio rerio), também conhecido como paulistinha. Cada vez mais usado em pesquisas de neurociências e farmacologia, o uso deste peixe é uma abordagem promissora na ecotoxicologia, cujos resultados apresentam forte correlação com testes de toxicidade aguda com peixes adultos.
Por sua vez, os embriões de paulistinha permitem a análise de vários pontos de estudo que vão desde a determinação da toxicidade aguda até ensaios de desenvolvimento para análise genética e fisiológica funcional complexa. Nativo da Ásia, é um modelo biológico intermediário entre o cultivo celular e os roedores.
O teste com embriões é considerado como método alternativo ao uso de animais de acordo com a diretriz da União Europeia (Directive animal welfare 2010/63/EU). De acordo com esta diretriz, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos; as fases de vida iniciais dos animais não são definidas como protegidas. Portanto, não se enquadram na legislação que trata com a experimentação animal. A alimentação de forma independente é considerada como o estágio a partir do qual as larvas de vida livre são objeto de regulamentação para a experimentação animal. As larvas de paulistinha apresentam alimentação ativa/independente após 120h da fertilização.
Embriões de zebrafish. Foto: Zaira Clemente
Outras vantagens
No mundo inteiro, o paulistinha tornou-se um bom modelo de pesquisa biomédica e ecotoxicológica. Recebe cada vez mais atenção, uma vez que são considerados como método de substituição de experimentos com animais. De acordo com matéria divulgada pela Revista Pesquisa Fapesp, de julho de 2013, em alguns testes, pode funcionar como uma alternativa ao uso de roedores. Em outros, pode oferecer informações complementares. Também pode ser usado para investigar os efeitos do estresse no sistema nervoso central e no comportamento.
Estudos internacionais consideram o paulistinha uma ferramenta promissora para a análise e seleção de compostos candidatos a medicamentos. Com esse peixe, espera-se acelerar e baratear o processo. Seu ciclo de vida é rápido – em quatro dias (96h) vários dos seus órgãos estão formados – e as larvas, que nascem às centenas a cada postura, com poucos milímetros de comprimento, podem ser acomodadas em vários poços das placas teste. Isto viabiliza o uso de pequenas quantidades dos compostos a serem testados e reduz o volume de resíduos gerados em um estudo.
“Nesse contexto, o Laboratório da Embrapa realizou testes com os ovos 1h após a fertilização, expostos individualmente em placas de poliestireno de 24 poços (com 2 mL da respectiva solução teste) e a diferentes concentrações de uma nanopartícula por 96h”, conforme explica a pesquisadora Vera Castro. Os embriões foram inspecionados diariamente. Houve interferência na eclosão das larvas, entre outros efeitos. Observou-se que este teste apresenta boa sensibilidade, praticidade e economia de recursos, podendo ser facilmente implantado em laboratório.
No Brasil, o Danio rerio é uma das espécies recomendadas nos teste de avaliação da ecotoxicidade aguda e cronica para o registro de produtos, segundo o “Manual de Testes de Avaliação da Ecotoxicidade de Agentes Químicos” do Ibama. Entretanto, o teste de avaliação da toxicidade embrio-larval não é descrito. Porém, alguns grupos no Brasil já desenvolvem pesquisas utilizando este teste. O desenvolvimento e implantação de metodologias alternativas é um processo complexo que abrange o desenvolvimento, a avaliação da relevância e a avaliação da confiabilidade até a aceitação e adoção por organizações regulatórias e comitês internacionais.
Espera-se que, com o maior uso deste modelo, o teste passe a integrar aqueles aceitos pelos órgãos regulamentadores a exemplo da recomendação de uso em substituição ao teste de toxicidade aguda recentemente publicada (julho/2014) pelo Centro Europeu para Validação de Métodos Alternativos (ECVAM).
O Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (Concea), vinculado ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação é responsável por estabelecer normas para a experimentação animal e substituir animais para propósitos científicos e didáticos quando existirem recursos alternativos. Neste contexto, o Concea poderá reconhecer o método alternativo validado e tomar decisões quanto à implementação de seu uso. A Capes foi a financiadora do estudo, juntamente com a Embrapa.
(Embrapa)